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细胞全能性和多能性是植物再生的细胞学基础.年,Science杂志公布了个最具挑战性的科学问题,其中植物细胞全能性被列为最重要的25个科学问题之一.植物体细胞的命运如何在激素作用下进行重编程,通过细胞分裂和分化发育成为一个独立的植株或器官是建立植物高效再生方法的理论基础.植物再生技术的发展和基因组编辑技术的应用将引领作物分子育种技术的变革,培育出更多高产、多抗、环境友好的未来作物,助推世界农业的可持续发展.

今天给大家推荐发表在中国科学生命科学的重磅综述文章《植物细胞全能性和再生》，该综述论文由许智宏,张宪省,苏英华,胡玉欣,徐麟以及王佳伟老师合作完成。本文回顾了新中国成立70年以来我国在植物组织培养和细胞全能性领域的研究成果和发展历程,通过总结国内外最新的研究进展提出本领域亟需回答的重要科学问题以及学科将来的发展方向.引言

再生(regeneration)是指生物体的组织或器官在受损或胁迫后自我修复或替换的过程.在动物中,如水螅、涡虫、棘皮动物(海星、海百合)等物种将其身体部分切割后,都能在伤口处再生出完整的形态.植物也具有强大的再生能力,例如,园艺上广为应用的扦插繁殖、很多植物地下根切段上和离体叶柄基部芽的再生;在树冠修剪后,树木受伤的枝条可以再生不定芽,发育为新的树冠等.

1植物细胞全能性的发现

生物体再生的细胞学基础在于细胞全能性(totipotency)和多能性(pluripotency).年,德国著名植物生理学家Haberlandt[1]根据细胞学说,大胆地提出了“细胞全能性”概念.他预测,植物体细胞具有可以在体外培养后脱分化并发育成完整植株的能力,为植物细胞全能性的诱导研究奠定了理论基础.Haberlandt将高等植物的各类组织细胞在培养基上进行离体培养,最终发现,有些细胞能够增大,却始终没有看到细胞分裂和增殖.

年,White和Nobécourt首次观察到植物组织培养过程中芽和根的发生.年后,Gautheret[2,]在组织培养过程中得到了榆树的幼芽和菊苣的幼苗.年,Levine[4]发现,在胡萝卜组织培养中移除生长素可以诱导芽的产生.在White实验的基础上,Skoog[5]发现,当烟草组织在固体培养基上培养时会产生不规则的生长,而当烟草组织被浸没在液体培养基内时会诱导芽的发生.随后,Skoog和Tsui(崔澂)[6]一起发现腺嘌呤(adenine)可以促进烟草茎外植体的细胞分裂,芽和根的发生是由培养基中腺嘌呤和生长素的平衡决定的.年,激动素(kinetin,一种细胞分裂素的类似物)被发现.年,Skoog和Miller[7]在此基础上发现,激动素可以有效地促进外植体的细胞分裂和芽再生.尤为重要的是,他们发现,高激动素/生长素比例诱导芽的发生而低激动素/生长素比例促进根的发生.这一发现奠定了植物组织培养中再生和细胞工程的基础,揭开了激素调控植物器官再生的秘密面纱.

为了证实Haberlandt提出的植物细胞全能性假说,需要证明单个植物细胞可以分裂,同时这个细胞可以通过细胞分裂与分化形成一个完整的植株.年,Muir等人[8]利用万寿菊愈伤组织建立了植物细胞悬浮系.他们通过愈伤组织哺育方法(nurseculturemethod)成功地观察到单个细胞可以分裂形成小的细胞团.年,Steward等人[9]将胡萝卜根韧皮部的细胞进行离体培养,发现这些细胞失去已分化细胞的结构特征并发生反复的细胞分裂,最终形成胚胎并发育成具有根、茎、叶等器官的完整植株.同年,德国科学家Reinert[10,11]也获得了类似的研究结果.此后科学家们经过50余年的不断实验,至今植物细胞的全能性已经得到充分验证.然而植物体细胞如何启动重编程重新获得细胞分裂的能力,进而表达全能性的分子机理目前仍不清楚.年,Science杂志在庆祝其创刊周年之际,公布了个最具挑战性的科学问题.其中植物细胞全能性被列为最重要的25个科学问题之一[12].

2植物细胞全能性的基本概念

随着分子生物学和细胞生物学理论的发展,细胞的多能性、全能性和再生已经逐渐从一个自然现象发展为再生医学和植物细胞工程的理论基础.在动物领域,体细胞可以在多个转录因子的诱导下重编程,成为具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的干细胞(stemcell),进而发育形成新的器官和组织;在植物领域,离体培养的植物组织和细胞也可以在植物激素的诱导下再生出新的器官或一棵完整的植株.

高等植物的器官起源于茎端分生组织(shootapicalmeristem,SAM)、根端分生组织(rootapicalmeristem,RAM)和侧生分生组织(lateralmeristem).存在于分生组织的干细胞既可以通过细胞分裂维持自身细胞群的大小,同时又可以进一步分化成为各种不同组织或者器官的细胞,从而构成机体各种复杂的组织器官.因此,它们是高等植物组织器官产生的来源,是植物发育无限性的细胞学基础[1].由于分生组织干细胞受到来源于周围已分化成组织形成的微环境信号的调控,它们只能分化各种器官而不能形成完整植株,因此被认为是具有多能性的植物干细胞[14].除植株的分生组织干细胞能够表现植物细胞的多能性而分化产生器官外,在胁迫、创伤或激素处理等离体培养条件下也能诱导产生新的植物组织或器官,实现植物细胞多能性的离体诱导[15].

植物细胞在一定条件下也能表现出细胞全能性,即单个植物细胞具有能够发育成为完整植株的潜在能力.在高等植物的有性生殖过程中,两个单倍体的配子(卵细胞和精细胞)融合后形成二倍体的单细胞受精卵,并继续发育成胚胎,最终形成完整的新植株.因此,单细胞受精卵具有发育成完整植株的能力,是植物中典型的全能性细胞.在自然界中,许多特殊的植物能够在卵细胞未受精的情况下产生胚胎,即无融合生殖现象.在无融合生殖植物中,胚胎可以由胚珠孢子体组织或未退化的配子体细胞直接发育而成[16].还有一些植物,如落地生根等可以在叶子的边缘通过器官发生和体胚再生的协同过程形成不定胚,然后通过胚胎发生完成植株发育[17].除此之外,植株上大多数组织和器官的体细胞只能表现一定的形态和生理功能,这是因为它们受控于其所在植株部位的特定生长发育环境.而当它们一旦脱离植株而处在离体状态、失去特定发育环境条件的制约,在一定的条件下,如胁迫、创伤或激素等外界条件刺激,植物体细胞就会进入重编程过程,进而表现出细胞全能性.

高等植物的再生可分为以下三种:组织修复(tissuerepair);器官从头再生,包括根从头再生(denovorootregeneration)和芽从头再生(denovoshootregeneration);体细胞胚再生(somaticembryogenesis)(图1).组织修复是指组织或器官在损伤或缺失后,可以修复或重新生长出能够替代原来组织器官行使功能的结构.根和芽的从头再生是指受伤或离体的植物组织长出不定根或不定芽的过程[18].器官从头再生是植物再生的重要方式,与体细胞胚再生不同,植物器官从头再生的过程仅需诱导外植体(explant,即离体组织或器官)形成SAM和RAM,无需经过类似胚胎发育的过程.体细胞胚再生是指已分化的体细胞在一定条件下脱分化获得分生能力,经过类似胚胎发育的过程形成完整植株[19].

我国在植物组织培养和细胞全能性领域的历史贡献

20世纪0~40年代,李继侗、罗宗洛、崔澂和罗士韦等教授开展了一系列植物组织培养工作.年,李继侗和沈同[20]发表的“银杏胚在体外的发生”“泛酸对酵母生长及银杏胚根在人工培养基中生长的效应”等文章是我国植物组织培养和器官培养的开端.这些文章首次报道了银杏胚乳中存在促进胚胎在体外培养基上生长发育的未知物质.受此研究成果的启发,vanOverbeek等人[21]在1年发现,椰奶(液态的胚乳)可以促进幼嫩曼陀罗胚胎的生长和发育,并最终奠定了细胞激动素的发现基础.2年,罗宗洛和罗士韦[22]研究了氮源对玉米离体根尖生长的影响.年,罗士韦和王伏雄[2]在世界上首次实现了裸子植物的胚胎体外培养.此后,罗士韦又建立了植物茎尖离体培养技术,成功地利用该技术使菟丝子在试管中长成植株并开花,开创性地将组织培养技术应用于实验研究.

20世纪50~60年代,国内开展植物组织和细胞培养工作的研究机构不多,科研人员主要从事一些基础性研究并试图与实际应用相结合.例如,中国科学院上海植物生理研究所罗士韦实验室开展了植物激素与愈伤组织生长以及人参等药用植物组织培养的工作;中国科学院植物研究所王伏雄实验室系统性地开展了植物幼胚培养工作;北京大学曹宗巽实验室通过建立黄瓜体外茎尖培养的方法,研究乙烯等激素对雌雄花性别决定的影响;北京大学李正理实验室利用胚培养研究胚根顶端纵切对根形态发生的影响.此外,还有一些育种机构尝试利用胚胎挽救(embryorescue)方法进行远缘杂交以获得杂种,并开展马铃薯脱毒苗的前期研究工作.令人遗憾的是,植物组织培养工作在当时特殊的历史时期下,时断时续.

年,Guha和Maheshwari[24]建立了毛叶曼陀罗的花药培养体系,并观察到类似胚胎状结构的产生.在此基础上,他们于年成功获得了毛叶曼陀罗单倍体植株[25].这两项工作为今后的花药培养和单倍体育种工作奠定了基础.年,Bourgin和Nitsch[26]利用类似的体系实现了烟草的单倍体诱导.年,Niizeke和Oono[27]首次实现了通过花粉培养体系诱导形成单倍体谷类作物.由于单倍体可以用于育种,因此这一方面的工作在“文化大革命”这一特殊时期下得到蓬勃发展.中国科学院遗传研究所、中国科学院植物研究所、中国农业科学研究院等单位在20世纪70年代早期便开展了相关研究,最多时,国内有数百家单位开展类似的工作,形成了单倍体育种的研究热潮.我国学者对水稻、小麦、玉米等禾谷类作物,油菜和多种蔬莱的花药培养做了系统的工作,并培育出一系列花培品种和品系.值得一提的是,中国科学院植物研究所朱至清和孙敬三等人[28,29]发现,低氨和过滤除菌的葡萄糖对水稻花粉的愈伤组织形成和体细胞胚发生具有促进作用,并在此基础上成功研制了适合小麦花药培养的N6培养基,这一培养基现已广泛用于禾谷类作物组织培养中.

年,英国诺丁汉大学科学家Cocking[0]首次利用纤维素酶酶解的方法获得了番茄幼苗根的原生质体.此后10年,商业化的纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶也逐渐发展成熟.20世纪70年代中后期,中国科学院植物研究所、中国科学院遗传研究所、中国科学院上海植物生理研究所、兰州大学、山东大学等科研院所和高校开始开展植物原生质体培养和体细胞杂交工作.除了摸索与建立原生质体培养体系外,还希望以原生质体为受体导入外源DNA/基因,或通过体细胞杂交,获得一些重要农作物的杂种.在这一方面,我国科学家做出了一系列出色的工作.一批重要农作物,包括水稻、小麦、玉米、高粱、谷子等禾谷类作物,重要豆科植物大豆、花生和蚕豆,以及多种果树和林木,通过原生质体培养获得了再生植株[1,2].

利用植物茎尖离体培养(shoottipculture)方法生产脱毒苗也是20世纪70年代我国植物组织培养和细胞工程研究的重要方向.脱毒苗在应用上最成功的首推马铃薯,在其他块根块茎类植物如薯蓣、甘薯和中药怀地黄,以及无性繁殖的果蔬类植物如香蕉和草莓等也取得了良好的效果,增产效果显著.广东省开展了利用组织培养技术创制无毒香蕉品系的研究,取得了良好的经济和社会效益.此外,国内一些研究单位开始研究和推广植物组织培养快繁技术,实现了规模化生产.试管苗在兰花、康乃馨、香石竹等花卉快繁中得到广泛应用.值得一提的是,广西和河北还开展了大规模的桉树和杨树试管苗快繁技术的研究,为保障我国木材自给做出了重要的贡献.

年起,利用植物细胞培养生产具有药用价值的植物次生代谢化合物成为国内植物组织培养领域的一个重要研究领域.中国科学院植物研究所叶和春实验室在这一领域取得多项重要研究成果.其中“新疆紫草细胞大量培养生产紫草宁衍生物”的研究成果经专家鉴定,认为该成果达国际先进水平.年,中国科学院昆明植物研究所实现了三分三(Scopoliaacutancula)、三七(Panaxnotogenseng)和萝芙木(Rauwolfiayunnanensis)等三种药用植物的愈伤组织培养.这些愈伤组织均保留了药用生物碱的生物合成能力.

总之,花药培养和单倍体育种、原生质体培养和体细胞杂交、脱毒和快繁技术以及植物细胞的次生代谢工程工作为我国培养了一大批优秀科研人才,积累了大量的植物组织培养的技术和经验.在这些应用性基础研究中还发现了许多有趣的生命现象.这些为改革开放后我国在植物组织培养和细胞全能性领域的快速发展奠定了坚实的基础.

4改革开放后我国植物组织和细胞培养领域的发展历程

年,“中澳植物组织培养”国际会议是“文化大革命”后中国科学院组织的一次大型国际会议.本次会议促进了中外学术交流,也让国外科学家了解到中国科学家在植物培养和细胞工程领域的工作.年8月,第四届国际植物组织细胞培养会议在加拿大卡加立(Calgary)大学召开,共有来自42个国家的多名科学家参会.中国科学院派出8名中国科学家代表中国首次参加了这个会议.中国科学院遗传研究所所长胡含在会上作了“中国花药培养的部分研究工作”的报告,引起了与会科学家的重视与兴趣.至此,我国植物组织和细胞培养研究迎来了一个崭新的发展期,研究重心逐渐从应用研究转向基础理论研究.同年,上海科技出版社出版了由中国科学院上海植物生理研究所细胞生理研究室编译的《植物组织和细胞培养》一书(图2).该书全面系统地介绍了植物组织和细胞培养的发展历史、原理基础、操作技术、应用范围和存在问题,在当时我国资料极度欠缺的情况下,为从事植物组织培养工作的科研人员及从事实际应用的工作人员提供了重要的学习和研究的基本教材.

20世纪80年代,分子生物学和遗传工程的兴起推动了国际相关领域研究的快速发展.国内的一些实验室逐步通过建立稳定的植物组织培养和再生体系,开展了一些重要植物发育和生理过程的研究.例如,中国科学院上海植物生理研究所许智宏和卫志明实验室[~5]开展了激素调控外植体器官发生的研究,发现了生长素极性运输对胚胎形态建成的影响.中国科学院植物研究所陆文樑实验室[6]利用风信子球茎鳞片外植体培养体系,在试管中实现了植物生殖器官的重新发生.值得一提的是,我国学者还先后通过柑橘、猕猴桃、水稻、枸杞等植物的胚乳培养,获得了三倍体植株,证明了胚乳三倍体细胞的全能性[7~40].此外,利用原生质体融合结合组织培养再生成为作物育种的一个新兴研究方向,出现了一大批体细胞杂种作物[41].

0年,许智宏组织召开了国内第一次以“植物发育调控机理的研究”为主题的香山会议.会议邀请了一批国内从事这方面研究的专家以及不少刚从海外留学归国的青年学者参会.本次会议推动了国内有关植物发育生物学和植物激素的研究,也促进了将遗传学和分子生物学的理念和技术引入植物组织培养中关于器官形成和胚胎发生的研究.

年,在美国奥兰多(Orlando)召开的第10届国际植物组织培养与生物技术大会上,许智宏当选国际植物组织培养和生物技术联合会主席(~).年,在北京召开的第11届国际植物组织培养与生物技术大会上,通过了由Vasil教授提议的将“国际植物组织培养和生物技术联合会”更名为“国际植物生物技术联合会”(InternationalAssociationforPlantBiotechnology,IAPB)的动议.这样,从最早的国际植物组织培养协会,到后来8年在以色列耶路撒冷(Jerusalem)召开的第9届国际植物组织和细胞培养大会上改名为国际植物组织培养和生物技术联合会,再到年北京会议上正式改名为国际植物生物技术联合会,反映了21世纪植物组织培养和细胞工程这一领域研究工作的发展趋势.

年科技部启动了“植物干细胞维持和分化的分子机理研究”重大研究计划项目.该项目围绕“植物干细胞维持、分化和功能获得的分子机制”这一关键科学问题开展研究,旨在解析植物干细胞维持、细胞分化、器官发生和花期控制和环境信号响应的遗传和表观遗传学基础以及高等植物细胞全能性的分子机理.在此基础上,科技部于年又资助了“微环境调控植物生长点干细胞中心维持与重建的分子网络”项目.该项目围绕“微环境调控植物生长点干细胞中心维持与重建的分子机制”这一关键科学问题,利用模式植物拟南芥和水稻丰富的遗传资源和基因组学信息,结合活体和离体研究体系及现代生物学技术手段,进一步系统地解析了植物生长点干细胞微环境调控干细胞中心维持和重建的分子网络.

年,基于CRISPR-Cas9(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/CRISPR-associatedproteins9)技术的新一代基因组编辑技术开始兴起.在过去的6年时间里,植物基因组编辑体系已经逐渐发展成熟,建立了从DNA片段的缺失、单碱基替换到长片段敲入(knockin)等一系列基因编辑技术体系.然而随着这些技术手段的快速发展,高效广谱植物再生体系匮乏的瓶颈效应日益凸显.直到今日,许多农作物(如大豆)的转化效率低下,水稻、玉米、小麦和棉花等重要农作物的转化具有很强的品种特异性.在此背景下,6年中国科学院启动了“植物特化形状形成及定向发育调控”战略先导B项目,将“植物细胞全能性和再生的分子机理”作为重要课题进行攻关.

5植物再生现象的机制和应用5.1嫁接与组织修复

嫁接是一种重要的营养繁殖技术.为了获得不同植物体各部位优良性状的整合,可以将一种植物的枝干或芽(称为接穗)嫁接到另一种植物的茎或根(称为砧木)上,并使这两部分生长为一个植株.这一技术在果树、瓜果等生产中被广泛使用.

嫁接的原理主要是基于植物具有组织修复这一再生能力.植物的茎秆、根尖、叶尖等部位都可以在受损后进行修补.很多实验室利用根尖切除或激光打击实验证实,在已部分分化的根尖细胞中可以利用生长素和伤口信号激活干细胞的程序来修复根端分生组织[42~48].在茎秆的伤口处,生长素、乙稀、茉莉素和赤霉素等植物激素共同作用,通过激活关键的转录因子基因(比如NAC家族和AP2/ERF家族基因)来修复受损的部位[49~52].在模式植物拟南芥(Arabidopsisthaliana)的研究中,发现了一类被伤口激活的基因WOUNDINDUCEDDEDIFFERENTIATION(WIND),它们编码AP2/ERF类转录因子,能够参与到多条植物伤口诱导的再生通路中[5~55].最近的研究发现,茉莉素等激素可能是植物伤口释放的信号,用于启动再生过程[46,47].这些对植物伤口促进再生的研究奠定了组织修复领域的基础.

在嫁接中,接穗和砧木之间维管组织的修复及连接是最关键的一步.利用模式植物拟南芥的下胚轴进行嫁接实验发现,生长素和细胞分裂素等激素都参与了这个修复过程[56,57].生长素可能通过ABERRANTLATERALROOTFORMATION4(ALF4)基因来控制修复过程.通过转录组数据分析发现,维管组织发育相关的基因、激素响应基因、糖响应基因等都在接穗和砧木之间呈现出不对称表达,说明整个修复过程中接穗和砧木起到的作用并不相同[57].另外,WIND等响应伤口的基因也可能对修复有作用[5,57].

虽然人们对植物嫁接的生理和分子研究有一些进展,但目前对于控制嫁接中组织修复的整个分子框架构建还不完善,控制组织修复的关键基因也有待于进一步发现.有些有趣的问题也很值得探索,比如亲缘关系比较远的植物为什么难以嫁接,嫁接后接穗和砧木之间的物质如何交流等.有实验报道,在不同物种进行嫁接后可能会发生细胞核内的遗传物质交流,通过核内染色体异源多倍化形成新物种,为农业育种提供了新的方法[58].

5.2扦插与根从头再生

扦插是将植物根从头再生的能力应用到农艺生产中的实例.离体的枝条、叶片等都可以作为扦插的材料进行营养繁殖(图A和B).对于扦插的生理现象研究有很长的历史[59].随着对植物激素生长素的研究,人们认识到生长素是根从头再生的核心激素.在20世纪0年代生长素的化学本质吲哚乙酸被揭示后,科学家们就发现,生长素和其人工合成的类似物,比如α-萘乙酸(α-naphthaleneaceticacid,NAA)和-吲哚丁酸(indole--butyricacid,IBA),都可以促进扦插中发根现象的发生[60~62].因此,人工合成的生长素类似物通常是发根粉的主要成分.

随后,人们建立了很多模式植物的扦插体系用于研究根从头再生过程,比如在矮牵牛(Petuniahybrida)[6]和拟南芥[64~66]中的各种不定根再生体系.基于这些研究体系,人们可以从生理、细胞和分子角度,对扦插过程中的再生现象进行研究.拟南芥离体叶片再生不定根是研究根从头再生的一个很方便实用的体系[66].将拟南芥的叶片剪下后,放在不含任何外源激素的培养基上,叶片可以自发再生出不定根(图B).由于拟南芥具有突出的遗传学、细胞学和分子生物学的研究优势,因此对于推动扦插技术的机制研究有很大的帮助.

现有的研究可以将扦插中再生不定根的过程归纳为三个连续的阶段[67](图C):第一阶段中,刚剪下的外植体(如茎段或叶片)会感受伤口和环境等上游信号;第二阶段中,这些上游信号会在叶肉、维管等细胞中指导生长素的合成,然后生长素被极性运输到伤口附近的形成层等干细胞中;第三阶段中,伤口附近的形成层等干细胞在高浓度生长素指导下进行细胞命运的转变,形成不定根.因此整个过程需要两大类细胞的协同工作:第一类是叶肉、维管等细胞,它们负责合成生长素;第二类是形成层等干细胞,它们能够转变命运,通过细胞分裂形成不定根.本文以拟南芥离体叶片再生不定根为例,描述三个阶段的详细过程.

在第一阶段,离体的茎段或叶片需要感知一系列复杂的上游信号,比如伤口信号、环境信号、自身的发育状态等.伤口是再生的重要启动因素.在扦插中,伤口扮演多个角色.首先,伤口产生了一个物理屏障,阻止离体组织和母体之间的物质交流(比如激素、糖类、代谢产物等).其次,伤口还释放了很多信号,用于提醒离体组织调动再生程序.目前对于激活再生的伤口信号知之甚少.一些物理和化学变化可能是最早的伤口信号,比如膜电势、ROS(reactiveoxygenspecies)和钙离子的变化;随后很多激素被调动起来行使伤口信号的传递作用,比如茉莉素和乙稀.在矮牵牛的扦插过程中,茉莉素会被伤口快速调动并促进生长素的产生[6,68].在拟南芥的离体叶片再生不定根过程中,茉莉素也起到了伤口信号的作用[46].茉莉素可以在拟南芥叶片剪下后10?min内快速在叶片中积累,并激活ETHYLENERESPONSEFACTOR(ERF)转录因子基因的表达;随后,ERF可以在伤口产生2小时内激活生长素合成通路基因ANTHRANILATESYNTHASEα1(ASA1).因此茉莉素作为伤口激素,将伤口信号转换成了生长素的合成信号,从而促进叶片再生不定根.环境信号对于扦插的效率也很重要.比如在拟南芥离体叶片再生不定根时,黑暗环境可以通过激活生长素合成通路基因YUCCA5/8/9(YUC5/8/9)来促进生长素的产生,从而提高再生效率[69].发育状态也影响离体的茎段和叶片的再生效率.比如幼嫩的拟南芥叶片比成熟叶片更容易再生不定根[70];处于相变前期年龄的叶片也比后期年龄的叶片容易再生不定根[71~7].因此总体来说,伤口信号、环境信号、发育状态等各种上游信号是扦插中不定根再生效率的关键因素,也是人为调整再生效率的重要入手点.

在第二阶段,各上游信号会促使叶肉细胞、维管细胞等合成生长素,随后生长素会被极性运输到伤口附近的干细胞中.生长素是根再生的核心激素,它是使干细胞命运转变的主要推动者.阻止生长素的合成、极性运输或信号转导,都会阻断整个再生过程.有趣的是,生长素的极性运输是有方向的,总是从生物学上端运往生物学下端.因此不定根通常都是在生物学下端的伤口处再生出来.但目前并不知道生长素极性运输的方向是何时决定的,也不知道其决定的具体机制.

在第三阶段中,汇集在伤口处形成层等干细胞的生长素促发了细胞命运转变,产生不定根.从形成层等干细胞最终形成不定根的过程,大致可以分成四个命运转变的步骤.第一步是从形成层等干细胞命运转变为不定根创始细胞(adventitiousrootfoundercell).生长素通过信号转导可以直接激活WUSCHELRELATEDHOMEOBOX11(WOX11)在不定根创始细胞中表达,启动根发育的程序.突变WOX11将导致再生不定根能力减弱,而过表达WOX11可以促进再生不定根[74].第二步是从不定根创始细胞命运转变为根原基细胞.此时根创始细胞开始分裂,形成一个穹顶状的根原基细胞团.在这一步中,WOX11可以激活WOX5/7和LATERALORGANBOUNDARIESDOMAIN16(LBD16)的表达.WOX5/7和LBD16的共表达是根原基特征的分子标记,它们的突变都会导致叶片再生不定根能力的缺陷[75].第三步是根原基分化成为根端分生组织的过程.此时LBD16将退出表达,而WOX5/7将被逐渐限制在根端干细胞微环境区域[75].第四步是成熟根尖的形成及顶出叶片的过程[76].经历了这四步的命运转变,叶片再生不定根的过程就基本完成了.

扦插技术虽然应用已久,但人们对于上游信号、生长素的产生和运输以及细胞命运转变的分子调控机制的了解还很有限.了解这些关键分子的作用机制后,它们都有可能成为提高再生效率的工具,应用于现代农业技术.

5.植物愈伤组织形成和芽从头再生的分子调控

愈伤组织(callus)指植物体受到外界损伤、病虫害侵染等时在损伤部位形成的不规则的细胞团,而在植物的离体再生体系中,离体组织或器官可通过植物激素的诱导定向形成具有再生能力的细胞团也被称为愈伤组织.愈伤组织诱导一直被认为是细胞脱分化获得全能性的过程.早期利用烟草原生质体诱导愈伤组织,发现在该过程中染色体会发生两轮解聚,并伴随着异染色质蛋白HP1蛋白的重新分布,组蛋白H,H9和H14乙酰化水平增加以及编码核糖体RNA的基因甲基化水平降低[77].此外端粒的长度、端粒酶的活性也随着细胞壁的解离发生改变[78,79].拟南芥的愈伤组织细胞与已分化的细胞相比,异染色质也发生了大规模解聚和重新排布[80].通过转录组学分析发现,拟南芥根外植体经CIM(callusinductionmedium)诱导后,与组蛋白修饰相关的N-乙酰转移酶类基因以及大量编码转录因子类基因表达显著上调[81],而拟南芥地上器官在外植体的愈伤组织诱导过程中,编码染色体重组因子、组蛋白去乙酰化酶、甲基转移酶和乙酰转移酶等表观遗传修饰相关基因也发生明显改变[82].

近年来利用模式植物拟南芥的离体再生体系揭示了植物离体器官愈伤组织的细胞起源和分子特征.拟南芥的根和下胚轴在诱导愈伤组织的培养基上,其木质部极的中柱鞘细胞首先发生几轮垂周分裂产生小细胞,接着再发生平周分裂,之后不断地进行细胞分裂形成愈伤组织[8].与此类似的是,拟南芥地上器官包括叶片和花瓣外植体的愈伤组织也是起始于维管周围特异表达中柱鞘标志基因的细胞,称为类中柱鞘细胞.如果用特异白喉毒素A链(diphtheriatoxinchainA,DTA)去除木质部极中柱鞘细胞,则外植体不能产生愈伤组织[84].因此,离体培养中不同外植体愈伤组织似乎主要起始于组织内的中柱鞘或类中柱鞘细胞.进一步以拟南芥根原基各细胞层标记分析来自根、子叶和花瓣为外植体愈伤组织的细胞属性发现,根原基分生组织的标志基因WOX5,SCARECROW(SCR),SHORTROOT(SHR)和PLETHORA1(PLT1)在愈伤组织中高度表达[8,85],说明愈伤组织细胞属性类似根端分生组织的特征.三种外植体愈伤组织诱导前后的转录组分析也表明,愈伤组织诱导后,根分生组织相关基因的表达发生明显上调;与茎端分生组织或者胚胎相比,愈伤组织的分子特性更类似于根分生组织[85].此外,侧根起始缺陷突变体alf4的根、子叶和花瓣外植体在CIM上不能形成愈伤组织[85],进一步佐证了生长素诱导的愈伤组织是中柱鞘类细胞以类似侧根发生的方式,具有根分生组织特征.

在离体愈伤组织诱导过程中,生长素被认为对细胞命运的转化起决定作用,这也在很多物种的离体再生体系实践中的得到了印证.拟南芥生长素信号因子功能获得突变体indole--aceticacid14/solitary-root(iaa14/slr)表现出侧根和愈伤组织形成的缺陷,而位于IAA14和生长素信号因子AUXINRESPONSEFACTOR7(ARF7)和ARF19下游的LBD类转录因子在愈伤组织形成过程中起到了关键的作用[86].在CIM诱导条件下,受生长素诱导的LBD16,LBD17,LBD18和LBD29在中柱鞘类细胞中被迅速诱导,超表达其中任何一个LBD转录因子则引起植株和外植体在无激素培养基上自主形成愈伤组织;而LBD功能缺失则严重抑制外植体愈伤组织在CIM上的形成[86].拟南芥LBD转录因子可以与另一类转录因子BASICREGION/LEUCINEZIPPERMOTIF59(bZIP59)形成转录复合体来调控生长素诱导的愈伤组织形成[87].对LBD29的直接靶基因分析也发现,愈伤组织形成过程中涉及了甲基化、活性氧特别是脂类和细胞壁相关的代谢变化[88].与之相一致的是,LBD16-bZIP59复合体也直接调控了细胞壁组分代谢基因FAD-bindingBerberine(FAD-BD)的表达[87],而LBD18不仅调控了细胞周期中关键作用的转录因子E2PROMOTERBINDINGFACTORa(E2Fa)的表达,也直接调控激活细胞壁松弛因子基因的表达[89],说明细胞壁的动态重塑过程也是愈伤组织形成的重要因素.

目前的研究显示,外植体在诱导愈伤组织培养基上形成愈伤组织过程中,除了能够促进中柱鞘类细胞增殖外,其细胞命运转变为根分生组织的特性对于获得芽再生能力非常重要.在此过程中,生长素可以诱导PLT,PLT5和PLT7的表达,而三个转录因子又可激活根分生组织的特征基因PLT1和PLT2以及芽再生特征因子CUP-SHAPEDCOTYLEDON1(CUC1)和CUC2的表达从而赋予愈伤组织再生芽的能力[90].pltplt5plt7突变体在CIM培养基上愈伤组织形成正常,但是它们的愈伤组织不能再生芽,而过表达PLT1和CUC1能够恢复pltplt5plt7突变体愈伤组织的芽再生能力[90].综上,这些发现表明,获得根分生组织特性包括PLT1,WOX5以及SCR等的激活可能是赋予愈伤组织芽再生能力的必要因素(图4).

有意思的是,通过筛选拟南芥iaa14/slr的抑制子发现,超长链脂肪酸含量降低会增强植物的愈伤组织形成能力;而外施超长链脂肪酸会抑制中柱鞘细胞的愈伤形成能力,说明超长链脂肪酸或其衍生物很可能作为限制植物器官的愈伤组织形成的信号存在(图4).超长链脂肪酸作为信号分子调控愈伤组织形成并不依赖于生长素调控侧根发生的IAA14信号通路,而是通过抑制中柱鞘类细胞分生能力关键基因ALF4的表达实现的[91].

年,Skoog和Miller[7]发现,将愈伤组织转移到高细胞分裂素的生芽培养基(shoot-inducingmedium,SIM)上是诱导芽再生的必需条件[15].通过遗传学、活体细胞成像和分子生物学等手段,拟南芥芽再生的分子框架图以及细胞分裂素诱导茎端分生组织重新建立的“two-step”模型被相继提出.WUSCHEL(WUS)是芽从头再生的重要调控因子.WUS是第一个被发现的WOX基因,它在SAM干细胞龛的组织中心(organizercenter,OC)表达,对于维持SAM干细胞活性至关重要[92,9].研究发现,wus突变体完全丧失芽再生能力,表明WUS也是调控芽再生的关键因子[94].根据WUS的表达特征,将芽再生过程划分为四个时期:在芽再生起始阶段,WUS非常特异地表达在单个细胞中,之后经历细胞增殖的过程,随后分化出茎端分生组织干细胞.WUS的表达直接受到细胞分裂素信号途径关键因子——B型ARABIDOPSISRESPONSEREGULATOR(ARR)转录因子的调控.B型ARR直接结合到WUS启动子区域,并激活WUS的表达[95,96].B型ARR对WUS的激活分为两步,具有严格的时空性.首先,高细胞分裂素环境会导致WUS座位出现重编程.随着愈伤组织的细胞分裂,WUS座位的HK27me表观抑制修饰逐渐丢失,在2~天后,WUS座位的染色质处于打开状态,可以被B型ARR激活.WUS重新激活的空间特异性与microRNA/6(miR/6)靶标的HOMEODOMAIN-LEUCINEZIPPERIII(HD-ZIPIII)的转录因子密切相关.与B型ARR的遍在表达不同,HD-ZIPIII仅在愈伤组织的一部分细胞中表达.HD-ZIPIII能够特异性地与B型ARRs结合,形成转录复合体激活WUS,从而决定了WUS表达的空间特异性[95](图5).

芽再生能力受到内源和外源因素的共同影响.由于芽的再生能力伴随植物年龄增长而递减,因此在组织培养过程中,通常选取胚胎期和幼年期的组织作为外植体.研究发现,虽然幼年期和成年期叶片的细胞分裂素含量没有差异,但是提高细胞分裂素浓度可以恢复成年期植物叶片再生能力下降的缺陷.进一步研究表明,在拟南芥和烟草中,年龄途径关键调控因子miR的含量与植物再生能力呈正相关:过量表达miR可以显著提高叶片的茎尖再生率.从分子机制上看,随着植物年龄的增长,miR的表达逐渐降低,导致其靶基因SQUAMOSAPROMOTERBINDINGPROTEIN-LIKE(SPL)类转录因子含量的上升.SPL可以与细胞分裂素信号途径的关键转录因子B-ARR结合,导致B-ARR的转录激活活性受到抑制,呈现细胞分裂素的不敏感性,进而导致茎尖再生能力的下降.这一研究成果表明,年龄途径可以通过调控细胞分裂素的信号输出调控植物的再生能力,提示年龄可能是植物细胞全能性的一个重要调控因素[97].

除了WUS座位的HK27me擦除外,LYSINE-SPECIFICDEMETHYLASE1-LIKE(LDL)介导的组蛋白HK4me2去乙酰化也是芽再生的一个先决条件.缺失LDL会导致芽再生能力的显著下降[98].研究发现,在CIM培养的后期,LDL会擦除芽再生相关基因座位的HK4me2表观标记.有趣的是,HK4me2表观标记的擦除虽然并不会立刻导致这些基因表达量的改变,但是会让这些基因处于一种准备(priming)状态.当愈伤组织转移到SIM培养基上后,这些基因便快速被诱导表达,激活芽再生的发育程序.

5.4体细胞胚胎发生

与通过愈伤组织-芽再生技术实现植物再生不同,多种植物外植体可以通过离体培养诱导胚胎发生,包括雄配子体和雌配子体的单倍体细胞诱导[99]和孢子体的营养体细胞诱导[],即体细胞胚胎发生(somaticembryogenesis).体细胞胚胎发生是指植物体细胞在未经生殖细胞融合的情况下,模拟有性的合子胚胎发生而发育形成一个新个体的形态发生过程,它是诱导植物细胞实现全能性的一种形式.除最早建立的胡萝卜体细胞胚的离体诱导系统外,很多植物的小孢子可以改变分化命运,并经胚胎发生途径形成单倍体植株,这一过程称为花粉胚胎发生.在这个过程中,小孢子细胞需要首先受到营养饥饿、低温或高温等外界环境胁迫的诱导,使细胞发育停滞,细胞命运发生重编程启动胚胎发育模式.此时将小孢子细胞转移到正常培养环境,它会持续进行分裂,并最终形成体细胞胚[].20世纪90年代起,拟南芥体细胞胚胎发生系统已经开始建立,随后逐步完善.拟南芥叶片原生质体能够诱导体细胞胚的产生,但是诱导频率很低,并且体细胞胚的发育会终止在球形胚早期[,10].Sangwan等人[]和Wu等人[]报道了以未成熟合子胚作为外植体首先诱导胚性愈伤组织的产生,进而诱导体细胞胚胎发生.在这个系统中,从合子胚诱导获得的体细胞胚可以发育成为完整植株,而合子胚外植体的发育时期对于诱导愈伤组织的形成和体细胞胚胎发生至关重要[].年,Ikeda-Iwai等人[]进一步完善了上述培养体系.在新体系中,合子胚外植体首先诱导产生初级体细胞胚,然后在液体培养基中悬浮培养产生胚性细胞团,进而诱导产生次级体细胞胚.这种液体培养系统不仅提高了胚性细胞的增殖速率,还增加了次级体细胞胚的数量.离体培养诱导的体细胞胚胎发生被认为是植物细胞全能性的完全呈现.因此,研究体细胞胚胎发生的分子机理对于揭示细胞全能性表达机制具有十分重要的意义.

植物的体细胞经过重编程过程形成胚性愈伤组织,再从愈伤组织的某些胚性细胞分化形成体细胞胚,这个过程称为体细胞胚的间接发生途径.现有的绝大多数体细胞胚胎发生的机理研究都是在间接发生系统中进行的.与芽再生类似,诱导体细胞胚产生的胚性愈伤组织从中柱鞘细胞和非中柱鞘类细胞发育而来[,].胚性愈伤组织形成后,在愈伤组织的表面或内部首先产生由分裂旺盛、排列紧密的小细胞组成的胚性细胞团,单个或多个胚性细胞被选择从胚性细胞团中发育成为体细胞胚[,].通常在用生长素类似物特别是2,4-D处理后能观察到愈伤组织和胚性细胞团(图6)[].虽然生长素促进愈伤组织和胚性细胞团的起始和增殖,但是体细胞胚的间接诱导通常需要将外界环境中的生长素去除,才能启动体细胞胚胎发生和胚胎的形态建成[].

在体细胞胚的直接发生途径中,其特征是没有明显的愈伤组织诱导阶段(图1).单个或多个胚性细胞被选择后直接发育成为形态学上可识别的胚[11].目前很多研究认为,外植体直接或间接的体细胞胚发生的能力可能取决于外植体的年龄:外植体离合子胚阶段越远,就需要越多的细胞重编程过程形成胚性愈伤组织,进而诱导体细胞胚.但也有一些外植体诱导体细胞胚发生时,无论组织的发育程度如何,它们都可以通过直接或间接途径产生体细胞胚[,,].例如山茶子叶基部的表皮细胞能够直接诱导产生体细胞胚.而利用槐树子叶进行离体培养时,在切口处产生愈伤组织诱导体细胞胚胎发生的同时,也可以由子叶细胞直接诱导产生体细胞胚.因此,在确定胚胎发生是直接还是间接时,似乎外植体细胞或组织的发育背景与培养环境的结合比其与合子胚时期的发育距离更为重要.

由于一直缺乏直接证据,不论是通过直接发生途径还是间接发生途径,体细胞胚发生究竟起源于单细胞还是多细胞成为亟待解决的关键科学问题之一.研究表明,间接的体细胞胚胎发生需要茎端分生组织的重新诱导形成[].拟南芥茎端分生组织干细胞关键基因WUS最先在胚性愈伤组织的一小团细胞中特异激活表达,此时并未观察到形态可见的体细胞胚,而另一个干细胞特征基因CLV随后在球形体细胞胚形成阶段被迅速诱导表达,标志着愈伤组织中干细胞的出现和茎端分生组织的逐步形成.影响拟南芥根端分生组织形成的关键调控因子WOX5和PLT2的表达模式与体细胞胚发生过程中胚根分生组织的建立有关[].WOX5与WUS在体细胞胚发生过程中的早期就被诱导表达,并且二者诱导表达时在胚性愈伤组织的表达区域基本重叠,说明愈伤组织诱导体细胞胚的过程在该体系中可能是由多细胞起始的(图5).而外植体直接诱导体细胞胚胎发生是由单个细胞还是多个细胞直接发育成体细胞胚,目前尚不清楚.

近年来,关于体细胞胚胎发生的分子机理已经有了较深入的研究,一些参与体细胞胚发生的重要的转录因子被鉴定出来,它们可以归为以下4类.第一类,拟南芥合子胚发育过程中的许多关键基因在诱导体细胞胚胎发生过程中起着十分重要的作用(图6).LEAFYCOTYLEDON(LEC)蛋白LEC1和LEC2是最初被发现的在幼苗中异位表达能诱导体细胞胚产生的转录因子[,].LEC1和LEC2是拟南芥合子胚特异表达的转录因子,它们突变体的胚子叶上长出具有真叶特征的表皮毛,并且种子中不积累贮藏蛋白[~].LEC1和LEC2的异位表达能够在拟南芥幼苗的子叶和真叶上诱导体细胞胚的形成[,].在合子胚发生过程中,ABA-INSENSITIVE(ABI)和FUSCA(FUS)基因的表达起始于较早的时期,并且一直持续到胚胎发生后期.其超表达不能诱导体细胞胚的产生,但确实赋予真叶具有子叶的特征,如无表皮毛等[,].第二类可以诱导体细胞胚胎发生的转录因子是RWP-RKDOMAIN-CONTAINING4(RKD4)/GROUNDED(GRD)[].RKD4在早期合子胚的胚本体和成熟胚胎的胚柄中表达.RKD4的突变导致胚柄变短和胚胎发育停滞,而幼苗中RKD4的过量表达会使根细胞过度增殖,并从中再生出体细胞胚[].第三类转录因子称为BABYBOOM(BBM),它是AP2/ERF转录因子中AINTEGUMENTA-LIKE(AIL)分支的成员之一[12],它的异位表达能够在没有外源激素的情况下使拟南芥幼苗的真叶和子叶上均能诱导体细胞胚的产生[12].在水稻中,BBM的过量表达能够诱导卵细胞在未受精的情况下进行细胞分裂并产生胚,实现孤雌生殖[].第四类转录因子属于AP2/ERF转录因子家族.WIND1及其同源基因能够被损伤诱导表达,并且在植物组织受损后能刺激愈伤组织细胞的增殖[5].WIND1异位表达促进芽、下胚轴和根等外植体产生愈伤组织[5],并在愈伤组织上诱导芽、根或体细胞胚的产生[].此外,在拟南芥中过量表达WUS能够诱导芽和体细胞胚的发生[94,,].上述研究表明,在植物发育过程中,多种不同类型的转录因子过表达都能诱导体细胞胚的产生.其中,一些转录因子在早期胚胎发育或后期维持胚成熟特征方面具有重要作用.

植物激素在体细胞胚的诱导过程中起着重要作用.去除外源生长素诱导体细胞胚胎发生后,首先在胚性愈伤组织的表面出现多个生长素响应的区域,进而发现体细胞胚即起始于这些生长素响应信号集中的愈伤组织区域.因此,体细胞胚的诱导与生长素响应信号的极性分布相关.进一步分析生长素极性运输蛋白PINFORMED(PIN)的分布模式,结果显示,在将形成体细胞胚的愈伤组织细胞中存在生长素的极性运输.而生长素极性运输抑制剂NPA(N-1-naphthylphtha-lamicacid)的施加则抑制了体细胞胚的产生[].胚性愈伤组织中生长素响应梯度的建立是诱导茎端分生组织干细胞形成的关键信号.因此,在体细胞胚的诱导过程中,生长素极性运输决定了愈伤组织中生长素的响应模式,从而诱导并维持茎端分生组织干细胞的产生.除生长素外,其他激素也在体细胞胚的诱导过程中起重要作用.通过分析细胞分裂素在体细胞胚起始过程中的响应模式发现,细胞分裂素响应信号出现的区域能够诱导WOX5的表达从而导致体细胞胚的形成.过表达拟南芥细胞分裂素信号转导途径的反馈抑制子ARR7与ARR15能够影响根端分生组织及体细胞胚的形成.这些结果为人们认识生长素与细胞分裂素调控体细胞胚胎发生过程中基-顶轴的极性建立及顶端分生组织的形成提供了重要的信息[].研究还表明,体细胞胚的诱导引起乙烯合成和信号转导的下调,这对于YUC基因介导的生长素区域性合成是必需的[].过量乙烯通过抑制YUC基因介导的生长素区域性合成,干扰生长素响应信号的极性分布,最终抑制体细胞胚胎发生.体细胞胚胎发生伴随着内源ABA(abscisicacid)水平的不断下降.然而,阻断内源ABA的合成途径,也影响生长素极性分布模式的建立,进而抑制体细胞胚胎发生过程.ABA通过影响愈伤组织中生长素的合成、极性运输和极性分布从而调控体细胞胚的发生[].

6学科发展的方向与展望

随着植物再生和细胞全能性分子机理的深入研究,细胞生物学和分子遗传学的广泛应用,传统教科书中关于组织培养和植物再生的一些经典理论受到了挑战:是不是所有的植物细胞都具有再生能力(目前可以说肯定不是,例如,因为植物在生长发育过程中,随细胞分裂,会产生大量的体细胞变异,甚至染色体的组型有大的改变,如出现多倍性、非整倍体等,这些都会影响全能性表达)?再生能力的实现是否都要经历细胞脱分化过程?愈伤组织为什么是非均一的细胞团?如何进一步理解和更新愈伤组织的概念?植物和动物在再生过程中采取了很多类似的细胞和分子策略,这种可能是趋同进化的结果是否可以互相借鉴?对这些问题的回答将帮助人们进一步认识再生的本质.

提高作物的再生效率是今后植物组织培养和细胞工程的一个重要发展方向.不管是动物还是植物,再生能力与个体年龄密切相关.随着个体年龄的增加,再生能力逐渐降低.体细胞胚的发生一般选取幼嫩的胚作为外植体,而器官从头再生一般选取幼苗期的组织.那么在种子萌发后,体细胞胚的发生能力为什么会大大下降呢?为什么大多数植物的成年期外植体不能在激素的作用下形成具有分化潜能的愈伤组织呢?此外,在长期继代培养中,愈伤组织的再生能力也会逐渐下降,其背后的分子机理至今也未阐明.这些问题的解答,将有助于人们更好地理解年龄如何调控植物细胞命运的转变和再生潜能,并在此基础上建立一套高效的再生系统.

目前对于器官从头再生和体细胞胚的诱导发生的细胞学及分子水平的研究都比较少,根、芽和体细胞胚是起源于外植体的单细胞还是多细胞?这些根、芽和体细胞胚来源于外植体的哪些类型的细胞?这些细胞是如何在伤口、愈伤组织和胚性细胞团中被选择而进行重编程,从而分化为根尖、茎尖和体细胞胚?在细胞命运重编程的过程中,哪些调控因子被诱导表达并起到关键的调控作用,是一个什么样的网络?这些问题尚不清楚.目前单细胞测序及基因编辑等技术已经越来越广泛地应用于植物细胞的谱系追踪及细胞分化命运的研究中,今后需要利用这些先进技术并结合传统研究方法,分析体细胞分化为根端/茎端分生组织和胚胎细胞的基因表达谱,鉴定决定体细胞全能性表达的关键因子,以解析植物细胞全能性和多能性诱导表达的分子遗传网络.

植物细胞全能性和多能性的诱导发生机理一直是植物科学研究领域极为重要的科学问题.具有细胞全能性和多能性的细胞究竟具有怎样的特征,二者有何区别?它们在染色质水平、基因表达水平究竟有着怎样的特殊性?细胞表达全能性的开关因子是什么,它是如何启动细胞重编程进入胚胎发育程序?回答植物如何从一个单细胞通过细胞分裂和分化产生一个个体是植物发育生物学领域的核心问题.该问题的解答,将为人们建立一套普适的植物再生方法提供理论基础.可以预见这些新技术的发展将和基因组编辑技术相结合将作物的分子育种技术提升到一个新的水平,在短时间内培育出更多高产、多抗、环境友好的未来作物,保证世界农业的可持续发展.

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